聚丙烯酰胺凝膠電泳簡(jiǎn)稱為PAGE（Polyacrylamide gel electrophoresis），是以聚丙烯酰胺凝膠作為支持介質(zhì)。它在樣品介質(zhì)和聚丙烯酰胺凝膠中加入離子去污劑和強(qiáng)還原劑后，蛋白質(zhì)亞基的點(diǎn)泳遷移率主要取決于亞及分子量的大小，而電荷因素可以被忽略。當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)的分子量在15KD到200KD之間時(shí)，電泳遷移率與分子量的對(duì)數(shù)呈線性關(guān)系，可以用來(lái)測(cè)定蛋白質(zhì)亞基的分子量。聚丙烯酰胺凝膠是由單體的丙烯酰胺（CH2=CHCONH2 Acrylamide）和甲叉雙丙烯酰胺（CH2(NHCOHC=CH2) 2 N,N'-methylenebisacrylamide）聚合而成，這一聚合過(guò)程需要有自由基催化完成。常用的催化聚合方法有兩種：化學(xué)聚合和光聚合?；瘜W(xué)聚合通常是加入催化劑過(guò)硫酸銨（AP）以及加速劑四甲基乙二胺（TEMED），四甲基乙二胺催化過(guò)硫酸銨產(chǎn)生自由基：以R·代表自由基，M代表丙烯酰胺單體，這樣由于乙烯基"CH2=CH－"一個(gè)接一個(gè)的聚合作用就形成丙烯酰胺長(zhǎng)鏈，同時(shí)甲叉雙丙烯酰胺在不斷延長(zhǎng)的丙烯酰胺鏈間形成甲叉鍵交聯(lián)，從而形成交聯(lián)的三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。氧氣對(duì)自由基有清除作用，所以通常凝膠溶液聚合前要進(jìn)行抽氣。丙烯酰胺的另一種聚合方法是光聚合，催化劑是核黃素，核黃素在光照下能夠產(chǎn)生自由基，催化聚合反應(yīng)。一般光照2－3小時(shí)即可完成聚合反應(yīng)。 聚丙烯酰胺凝膠分離蛋白質(zhì)較初是在玻璃管中進(jìn)行的，玻璃管通常直徑為7 mm，長(zhǎng)10 cm，將凝膠裝入到多個(gè)管中進(jìn)行電泳，又稱為柱狀電泳。目前仍有應(yīng)用，尤其用于二維電泳中的優(yōu)質(zhì) 維電泳。但由于各個(gè)玻璃管的不同以及裝膠時(shí)的差異使每管的分離條件會(huì)有所差異，所以對(duì)各管樣品進(jìn)行比較時(shí)可能會(huì)出現(xiàn)較大誤差。后來(lái)發(fā)展起來(lái)的垂直平板電泳一次較多可以容納20個(gè)樣品，電泳過(guò)程中樣品所處的條件比較一致，樣品間可以進(jìn)行更好的比較，重復(fù)性也更好，所以垂直平板電泳目前應(yīng)用的更為廣泛，常用于蛋白質(zhì)及DNA序列分析過(guò)程中DNA片段的分離、鑒定。 水平平板電泳近年來(lái)也有很快的發(fā)展，與垂直平板電泳相比也有其獨(dú)特的優(yōu)點(diǎn)：①由于凝膠可以直接鋪在冷卻板上，容易使凝膠冷卻，因而可以加高電壓以提高分辨率。②電泳速度快，通常只要1小時(shí)左右，而園盤電泳和垂直平板電泳一般需要3～4小時(shí)。③因?yàn)榭梢允褂帽∧z，加樣少，染色快，從而提高了靈敏度，而且容易保存，只要用甘油浸泡后自然干燥即可長(zhǎng)期保存不會(huì)龜裂。④便于適用各種電泳方式，用途廣泛，尤其是可以使用90年代才發(fā)展起來(lái)的只有水平電泳系統(tǒng)才能使用的新的半干技術(shù)，即用浸有少量緩沖液的半干的膠條代替通常所用的大量電很 緩沖液，大大節(jié)約了試劑，簡(jiǎn)化了操作，提高了電泳速度。 聚丙烯酰胺凝膠的孔徑可以通過(guò)改變丙烯酰胺和甲叉雙丙烯酰胺的濃度來(lái)控制，丙烯酰胺的濃度可以在3％－30％之間。低濃度的凝膠具有較大的孔徑，如3％的聚丙烯酰胺凝膠對(duì)蛋白質(zhì)沒(méi)有明顯的阻礙作用，可用于平板等電聚焦或SDS－聚丙烯酰胺凝膠電泳的濃縮膠，也可以用于分離DNA；高濃度凝膠具有較小的孔徑，對(duì)蛋白質(zhì)有分子篩的作用，可以用于根據(jù)蛋白質(zhì)的分子量進(jìn)行分離的電泳中，如10％－20％的凝膠常用于SDS－聚丙烯酰胺凝膠電泳的分離膠。聚合后的聚丙烯酰胺凝膠的強(qiáng)度、彈性、透明度、粘度和孔徑大小均取決于兩個(gè)重要參數(shù)T和C，T是丙烯酰胺和甲叉雙丙烯酰胺兩個(gè)單體的總百分濃度。C是與T有關(guān)的交聯(lián)百分濃度。T與C的計(jì)算公式是： C = 6.5－0.3T 上式中a為丙烯酰胺的克數(shù)，b為甲叉雙丙烯酰胺的克數(shù)，m為水或緩沖液體積（ml）。式中a與b的比例很重要。富有彈性，且完全透明的凝膠，a與b的重量比應(yīng)在30左右。選擇T和C的經(jīng)驗(yàn)公式是： C = 6.5－0.3T此式可用于計(jì)算T為5％～20％時(shí)的凝膠組成。C值并不很嚴(yán)格，在大多數(shù)情況下，可變化的范圍約為 ±1％，當(dāng)C保持恒定時(shí)，凝膠的有效孔徑隨著T的增加而減小，當(dāng)T保持恒定，C為4％時(shí)，有效孔徑較小，C大于或小于4％時(shí)，有效孔徑均變大，C大于5％時(shí)凝膠變脆，不宜使用，實(shí)驗(yàn)中較常用的C是2.6％和3％。 操作流程： 1．安裝灌膠模具，依照說(shuō)明書進(jìn)行 2．按照配方配置一定量（7cm模具配置1mm厚的膠配置5ml）的分離膠溶液和濃縮膠溶液（2ml），過(guò)硫酸銨和TEMED在用前加入。 3．分離膠溶液充分混勻后從一側(cè)加入灌膠模具，上方留約1.5-2cm用于加濃縮膠，小心的在分離膠的表面加一層水飽和正丁醇（或水飽和的異丙醇、水），封住膠面，以促使聚合并保持膠面平整。 4．室溫放置40分鐘到1小時(shí)后，可以看到一個(gè)界面，去掉上層覆蓋液，用濃縮膠緩沖液淋洗膠面，然后灌制濃縮膠，并插入與模具大小相同，凝膠厚度相當(dāng)?shù)氖嶙印? 5．靜止放置40-60分鐘使凝膠聚合，電泳液清洗樣品孔。 6．制備好的蛋白質(zhì)樣品用2Xloading buffer 1：1混合，與分子量marker 一起100℃煮3-5min, 12000rpm離心5-10min，（7cm模具、1mm厚度、10孔、考染上樣量30ug） 7．加入下槽液，把夾有凝膠的玻板轉(zhuǎn)移到電泳槽，加入上槽液，上樣。 8．連接電源，5-10mA/膠開(kāi)始電泳，待溴酚藍(lán)前沿到達(dá)分離膠后加大電流到10-15mA/膠， 9．溴酚藍(lán)前沿到達(dá)玻璃板底部時(shí)停止電泳，取出凝膠，做好標(biāo)記，準(zhǔn)備染色。 10．染色。見(jiàn)考馬斯亮藍(lán)染色操作規(guī)程及銀染色操作規(guī)程。 11．掃描。掃描操作見(jiàn)掃描儀的使用說(shuō)明。 由于聚丙烯酰胺凝膠有突出的優(yōu)點(diǎn)，因而四十年來(lái)得到廣泛的應(yīng)用，目前尚無(wú)更好的支持介質(zhì)能夠取代它。其主要的優(yōu)點(diǎn)有：①可以隨意控制膠濃度"T"和交聯(lián)度"C"，從而得到不同的有效孔徑，用于分離不同分子量的生物大分子。②能把分子篩作用和電荷效應(yīng)結(jié)合在同一方法中，達(dá)到更高的靈敏度：10－9 ～10－12 mol/L。③由于聚丙烯酰胺凝膠是由－C－C－鍵結(jié)合的酰胺多聚物，側(cè)鏈只有不活潑的酰胺基－CO－NH2 ，沒(méi)有帶電的其他離子基團(tuán)，化學(xué)惰性好，電泳時(shí)不會(huì)產(chǎn)生"電滲"。④由于可以制得高純度的單體原料，因而電泳分離的重復(fù)性好。⑤透明度好，便于照相和復(fù)印。機(jī)械強(qiáng)度好，有彈性，不易碎，便于操作和保存。⑥無(wú)紫外吸收，不染色就可以用于紫外波長(zhǎng)的凝膠掃描作定量分析。⑦還可以用作固定化酶的惰性載體。 注意事項(xiàng) 1．在加過(guò)硫酸銨和TEMED之前溶液較好抽氣，防止溶解在溶液里的分子氧在聚合時(shí)產(chǎn)生氣泡使膠不均一。 2．過(guò)硫酸銨和TEMED的量應(yīng)根據(jù)室溫和聚合情況而定。 3．分離膠聚合后較好在4℃放置12小時(shí)后再使用，以使凝膠充分聚合，改善電泳時(shí)的分辨率。 4．為防止氣泡陷入，梳子應(yīng)傾斜插入。 5．如果帶著梳子過(guò)夜可能會(huì)影響分辨率，所以濃縮膠較好在使用前再灌制。 6．如果沒(méi)有足夠數(shù)目的樣品，應(yīng)在加樣孔中加樣品緩沖液，不要留有空孔，以防止電泳時(shí)鄰近的帶擴(kuò)展。 7．對(duì)樣品濃度不確定的情況下，加樣時(shí)使用梯度加樣法，能大致估計(jì)出樣品的濃度。 配成30％的丙烯酰胺水溶液在4℃下能保存1個(gè)月，在貯存期間丙烯酰胺會(huì)水解為丙烯酸而增加電泳時(shí)的電內(nèi)滲現(xiàn)象并減慢電泳的遷移率。丙烯酰胺和甲叉雙丙烯酰胺是一種對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)有毒的試劑，操作時(shí)要避免直接接觸皮膚，但它們聚合后則無(wú)毒。 未加SDS的天然聚丙烯酰胺凝膠電泳可以使生物大分子在電泳過(guò)程中保持其天然的形狀和電荷，它們的分離是依據(jù)其電泳遷移率的不同和凝膠的分子篩作用，因而可以得到較高的分辨率，尤其是在電泳分離后仍能保持蛋白質(zhì)和酶等生物大分子的生物活性，對(duì)于生物大分子的鑒定有重要意義，其方法是在凝膠上進(jìn)行兩份相同樣品的電泳，電泳后將凝膠切成兩半，一半用于活性染色，對(duì)某個(gè)特定的生物大分子進(jìn)行鑒定，另一半用于所有樣品的染色，以分析樣品中各種生物大分子的種類和含量。 更多聚丙烯酰胺相關(guān)信息，請(qǐng)登錄http://www.odmcc.cn佰科聚丙烯酰胺官方網(wǎng)站